Миозин хүнд гинжнээс гаднах хүний ​​араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн олон янз байдал

nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн туршлагыг авахын тулд бид хөтчийн хамгийн сүүлийн хувилбарыг ашиглахыг (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох) зөвлөж байна. Нэмж дурдахад, тасралтгүй дэмжлэг үзүүлэхийн тулд энэ сайт нь хэв маяг болон JavaScript-ээс ангид байх болно.
Араг ясны булчин нь голчлон миофибриллээс бүрдсэн олон янзын эд бөгөөд хүмүүст ихэвчлэн гурван төрөлд ангилагддаг: нэг нь "удаан" (1-р төрөл) ба хоёр нь "хурдан" (2А ба 2X төрөл). Гэсэн хэдий ч уламжлалт миофибрилийн төрлүүдийн хоорондын болон доторх олон янз байдал нь сайн ойлгогдоогүй хэвээр байна. Бид хүний ​​vastus lateralis-аас тус тус 1050 ба 1038 бие даасан миофибрилд транскриптомик ба протеомик аргыг хэрэглэсэн. Протеомик судалгаанд эрэгтэйчүүд, транскриптомик судалгаанд 10 эрэгтэй, 2 эмэгтэй хүмүүс хамрагдсан. Миозины хүнд гинжин изоформуудаас гадна бид бодисын солилцооны уургууд, рибосомын уургууд болон эсийн холболтын уургуудыг олон хэмжээст интермиофибрилийн хувьсах чанарын эх үүсвэр гэж тодорхойлсон. Цаашилбал, удаан ба хурдан ширхэгүүдийн кластеруудыг тодорхойлсон хэдий ч бидний өгөгдөл нь 2X төрлийн ширхэгүүд нь бусад хурдан таталттай ширхэгүүдээс фенотипийн хувьд ялгагдахгүй байгааг харуулж байна. Цаашилбал, миозины хүнд гинжин хэлхээнд суурилсан ангилал нь немалин миопати дахь миофиберийн фенотипийг тодорхойлоход хангалтгүй юм. Ерөнхийдөө бидний өгөгдөл нь миозины хүнд гинжин хэлхээний изоформуудаас давсан хэлбэлзлийн эх үүсвэртэй олон хэмжээст миофиберийн олон янз байдлыг харуулж байна.
Эсийн олон янз байдал нь бүх биологийн системийн салшгүй шинж чанар бөгөөд эсүүд эд, эсийн өөр өөр хэрэгцээг хангахын тулд мэргэших боломжийг олгодог.1 Араг ясны булчингийн ширхэгийн олон янз байдлын уламжлалт үзэл баримтлал нь мотор мэдрэлийн эсүүд нь мотор нэгжийн доторх ширхэгийн төрлийг тодорхойлдог бөгөөд ширхэгийн төрөл (өөрөөр хэлбэл хүний ​​1-р төрөл, 2А төрөл, 2X төрөл) нь миозин хүнд гинжин хэлхээний (MYH) изоформын шинж чанараар тодорхойлогддог гэсэн үзэл баримтлал юм.2 Энэ нь анхандаа тэдний рН АТФаза тогтворгүй байдал,3,4, дараа нь MYH-ийн молекулын илэрхийлэл дээр үндэслэсэн.5 Гэсэн хэдий ч олон MYH-ийг янз бүрийн харьцаагаар хамт илэрхийлдэг "холимог" ширхэгийг тодорхойлж, дараа нь хүлээн авснаар араг ясны булчингийн ширхэгүүдийг тусдаа ширхэгийн төрөл гэж үзэхээс илүү тасралтгүй гэж үзэх болсон.6 Гэсэн хэдий ч энэ салбар нь миофиберийн ангиллын үндсэн ангилагч болох MYH-д ихээхэн найддаг хэвээр байгаа бөгөөд энэ үзэл нь MYH илэрхийлэлийн профайл болон ширхэгийн төрлүүдийн хүрээ нь хүнийхээс ялгаатай эртний мэрэгч амьтдын судалгааны хязгаарлалт, мэдэгдэхүйц гажуудлаас үүдэлтэй байж магадгүй юм.2 Хүний янз бүрийн араг ясны булчингууд нь олон төрлийн ширхэгийн төрлийг харуулдаг тул нөхцөл байдал улам бүр төвөгтэй болж байна.7 Вастус латералис нь дунд зэргийн (тиймээс төлөөллийн) MYH экспрессийн профайлтай холимог булчин юм.7 Цаашилбал, дээж авахад хялбар тул хүний ​​хамгийн сайн судлагдсан булчин болгодог.
Тиймээс хүчирхэг "омикс" хэрэгслийг ашиглан араг ясны булчингийн ширхэгийн олон янз байдлыг шударгаар судлах нь чухал боловч бас бэрхшээлтэй бөгөөд энэ нь араг ясны булчингийн ширхэгийн олон цөмт шинж чанартай холбоотой юм. Гэсэн хэдий ч транскриптомик8,9 болон протеомикс10 технологиуд нь сүүлийн жилүүдэд янз бүрийн технологийн дэвшлийн ачаар мэдрэг чанарын хувьд хувьсгал хийсэн бөгөөд энэ нь араг ясны булчингийн нэг ширхэгийн нягтралтай шинжилгээ хийх боломжийг олгосон. Үүний үр дүнд дан ширхэгийн олон янз байдал болон тэдгээрийн атрофик өдөөлт болон хөгшрөлтөд үзүүлэх хариу урвалыг тодорхойлоход мэдэгдэхүйц ахиц дэвшил гарсан11,12,13,14,15,16,17,18. Чухал зүйл бол эдгээр технологийн дэвшил нь клиник хэрэглээтэй бөгөөд өвчинтэй холбоотой зохицуулалтын алдагдлыг илүү нарийвчилсан, нарийвчлалтай тодорхойлох боломжийг олгодог. Жишээлбэл, хамгийн түгээмэл удамшлын булчингийн өвчний нэг болох немалин миопатийн эмгэг жам нь нарийн төвөгтэй бөгөөд төөрөгдүүлсэн байдаг19,20. Тиймээс араг ясны булчингийн ширхэгийн зохицуулалтын алдагдлыг илүү сайн тодорхойлох нь энэ өвчний талаарх бидний ойлголтод мэдэгдэхүйц ахиц дэвшилд хүргэж болзошгүй юм.
Бид хүний ​​биопсийн дээжээс гараар тусгаарласан дан араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн транскриптомик ба протеомик шинжилгээний аргуудыг боловсруулж, мянга мянган ширхэгт хэрэглэснээр хүний ​​араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн эсийн гетероген чанарыг судлах боломжтой болсон. Энэхүү ажлын явцад бид булчингийн ширхэгүүдийн транскриптомик ба протеомик фенотипийн хүчийг харуулж, бодисын солилцооны, рибосомын болон эсийн холбоос уургуудыг ширхэг хоорондын хувьсах чанарын чухал эх үүсвэр гэж тодорхойлсон. Цаашилбал, энэхүү протеомик ажлын урсгалыг ашиглан бид дан араг ясны булчингийн ширхэгүүдэд нематод миопатийн эмнэлзүйн хамаарлыг тодорхойлж, MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлөөс үл хамааран исэлддэггүй ширхэгүүд рүү чиглэсэн зохицуулалттай шилжилтийг илрүүлсэн.
Хүний араг ясны булчингийн ширхэгийн олон янз байдлыг судлахын тулд бид дан араг ясны булчингийн ширхэгийн транскриптом ба протеомын шинжилгээг хийх боломжийг олгох хоёр ажлын урсгалыг боловсруулсан (Зураг 1A ба Нэмэлт Зураг 1A). Бид дээж хадгалах, РНХ болон уургийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахаас эхлээд арга тус бүрийн дамжуулах чадварыг оновчтой болгох хүртэл хэд хэдэн арга зүйн алхмуудыг боловсруулж, оновчтой болгосон. Транскриптомын шинжилгээний хувьд үүнийг урвуу транскрипцийн эхний шатанд дээжийн тодорхой молекулын бар кодыг оруулснаар үр дүнтэй дараагийн боловсруулалт хийхийн тулд 96 ширхэгийг нэгтгэх боломжийг олгосон. Уламжлалт дан эсийн аргуудтай харьцуулахад илүү гүнзгий дараалал (шилэн тутамд ±1 сая уншилт) нь транскриптомын өгөгдлийг улам баяжуулсан. 21 Протеомикийн хувьд бид өндөр дамжуулах чадварыг хадгалахын зэрэгцээ протеомын гүнийг оновчтой болгохын тулд timsTOF масс спектрометр дээр DIA-PASEF өгөгдөл цуглуулахтай хослуулан богино хроматографийн градиент (21 минут) ашигласан. 22,23 Эрүүл араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн олон янз байдлыг судлахын тулд бид 14 эрүүл насанд хүрсэн донороос авсан 1050 ширхэгийн транскриптом болон 5 эрүүл насанд хүрсэн донороос авсан 1038 ширхэгийн протеомыг тодорхойлсон (Нэмэлт Хүснэгт 1). Энэхүү өгүүлэлд эдгээр өгөгдлийн багцыг тус тус 1000 ширхэгийн транскриптом ба протеом гэж нэрлэдэг. Бидний арга барил нь 1000 ширхэгийн транскриптом ба протеомын шинжилгээнд нийт 27,237 транскрипт ба 2,983 уураг илрүүлсэн (Зураг 1A, Нэмэлт өгөгдлийн багц 1-2). Илэрсэн 1000 гаруй ген болон ширхэг тутамд 50% хүчинтэй утгуудын транскриптом ба протеомын өгөгдлийн багцыг шүүсний дараа транскриптом ба протеомын 925 ба 974 ширхэгийн биоинформатикийн шинжилгээг тус тус хийсэн. Шүүлтүүрийн дараа эслэг тус бүрт дунджаар 4257 ± 1557 ген болон 2015 ± 234 уураг (дундаж ± SD) илэрсэн бөгөөд хувь хүн хоорондын хувьсах чанар хязгаарлагдмал байв (Нэмэлт Зураг 1B–C, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 3–4). Гэсэн хэдий ч субъект доторх хувьсах чанар нь оролцогчдын дунд илүү тод илэрсэн бөгөөд энэ нь янз бүрийн урттай болон хөндлөн огтлолын талбайн хоорондох РНХ/уургийн гарцын зөрүүтэй холбоотой байж болох юм. Ихэнх уургийн хувьд (>2000) хувьсах коэффициент 20%-иас доош байсан (Нэмэлт Зураг 1D). Хоёр арга хоёулаа булчингийн агшилтад чухал ач холбогдолтой өндөр илэрхийлэгдсэн гарын үсэг бүхий транскрипт болон уургуудын өргөн хүрээний динамик хүрээг (жишээ нь, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) барих боломжийг олгосон (Нэмэлт Зураг 1E–F). Тодорхойлсон шинж чанаруудын ихэнх нь транскриптомик болон протеомик өгөгдлийн багцуудын хооронд нийтлэг байсан (Нэмэлт Зураг 1G) бөгөөд эдгээр шинж чанаруудын дундаж UMI/LFQ эрчим нь харьцангуй сайн хамааралтай байсан (r = 0.52) (Нэмэлт Зураг 1H).
Транскриптомик ба протеомик ажлын урсгал (BioRender.com ашиглан үүсгэсэн). BD MYH7, MYH2, болон MYH1-ийн динамик хүрээний муруйнууд болон шилэн кабелийн төрлийг хуваарилахын тулд тооцоолсон босго утга. E, F Транскриптомик ба протеомикийн өгөгдлийн багц дахь шилэн кабелийн MYH экспрессийн тархалт. G, H MYH дээр суурилсан шилэн кабелийн төрлөөр өнгөөр ​​будсан транскриптомик ба протеомикийн нэгдсэн олон янз байдлын ойролцоолол ба проекцийн (UMAP) графикууд. I, J Транскриптомик ба протеомикийн өгөгдлийн багц дахь MYH7, MYH2, болон MYH1 экспрессийг харуулсан онцлог графикууд.
Бид эхлээд омикс өгөгдлийн багц дахь MYH илэрхийллийн өндөр мэдрэмж болон динамик хүрээг ашигладаг оновчтой аргыг ашиглан шилэн бүрт MYH дээр суурилсан шилэн төрлийг оноохоор шийдсэн. Өмнөх судалгаанууд нь өөр өөр MYH-ийн илэрхийллийн тогтмол хувь дээр үндэслэн шилэн эсийг цэвэр 1-р төрөл, 2A төрөл, 2X төрөл эсвэл холимог гэж тэмдэглэхийн тулд дурын босго ашигласан11,14,24. Бид шилэн эс бүрийн илэрхийлэлийг шилэн эсийг тодорхойлоход ашигласан MYH-ээр эрэмбэлсэн өөр аргыг ашигласан: MYH7, MYH2, MYH1 нь тус тус 1-р төрөл, 2A төрөл, 2X төрлийн шилэн эсүүдтэй тохирч байна. Дараа нь бид үүссэн муруй бүрийн доод нугалах цэгийг математикийн аргаар тооцоолж, үүнийг босго болгон ашиглан MYH бүрийн хувьд эерэг (босго хэмжээнээс дээш) эсвэл сөрөг (босго хэмжээнээс доош) гэж шилэн эсийг оноож өгсөн (Зураг 1B–D). Эдгээр өгөгдөл нь MYH7 (Зураг 1B) болон MYH2 (Зураг 1C) нь уургийн түвшинтэй харьцуулахад РНХ-ийн түвшинд илүү тодорхой асаах/унтраах илэрхийллийн профайлтай болохыг харуулж байна. Үнэндээ уургийн түвшинд маш цөөхөн ширхэг нь MYH7 илэрхийлээгүй бөгөөд ямар ч ширхэг нь 100% MYH2 илэрхийлээгүй байв. Дараа нь бид өгөгдлийн багц дахь бүх ширхэгт MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлийг оноохын тулд урьдчилан тодорхойлсон илэрхийллийн босгыг ашигласан. Жишээлбэл, MYH7+/MYH2-/MYH1- ширхэгийг 1-р төрөлд хуваарилсан бол MYH7-/MYH2+/MYH1+ ширхэгийг холимог 2A/2X төрөлд хуваарилсан (бүрэн тайлбарыг Нэмэлт Хүснэгт 2-оос үзнэ үү). Бүх ширхэгийг нэгтгэн үзвэл бид РНХ (Зураг 1E) болон уургийн (Зураг 1F) түвшинд MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлүүдийн гайхалтай төстэй тархалтыг ажигласан бол MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлүүдийн харьцангуй найрлага нь хүлээгдэж байсанчлан хувь хүмүүсийн хооронд харилцан адилгүй байсан (Нэмэлт Зураг 2A). Ихэнх ширхэгийг цэвэр 1-р төрөл (34-35%) эсвэл 2A төрөл (36-38%) гэж ангилсан боловч холимог 2A/2X төрлийн ширхэгүүд нэлээд их хэмжээгээр илэрсэн (16-19%). Цэвэр 2X төрлийн ширхэгийг зөвхөн РНХ-ийн түвшинд илрүүлж болох боловч уургийн түвшинд илрүүлж чадахгүй байгаа нь гайхалтай ялгаа бөгөөд энэ нь MYH-ийн хурдан экспресс нь транскрипцийн дараа дор хаяж хэсэгчлэн зохицуулагддаг болохыг харуулж байна.
Бид протеомик дээр суурилсан MYH ширхэгийн типлэх аргыг эсрэгбие дээр суурилсан цэгэн блот ашиглан баталгаажуулсан бөгөөд хоёр арга хоёулаа цэвэр 1-р төрөл ба 2А төрлийн ширхэгийг тодорхойлоход 100% тохиролцоонд хүрсэн (Нэмэлт Зураг 2B-г үзнэ үү). Гэсэн хэдий ч протеомик дээр суурилсан арга нь илүү мэдрэмтгий, холимог ширхэгийг тодорхойлоход илүү үр дүнтэй, мөн ширхэг бүрт MYH ген бүрийн эзлэх хувийг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлсэн. Эдгээр өгөгдөл нь араг ясны булчингийн ширхэгийн төрлийг тодорхойлоход объектив, өндөр мэдрэмтгий омик дээр суурилсан аргыг ашиглах үр нөлөөг харуулж байна.
Дараа нь бид транскриптомик болон протеомикийн өгсөн хосолсон мэдээллийг ашиглан миофиберүүдийг бүрэн транскриптом буюу протеом дээр үндэслэн объектив байдлаар ангилсан. Хэмжээст байдлыг зургаан үндсэн бүрэлдэхүүн хэсэг болгон бууруулахын тулд жигд олон талт ойролцоолол ба проекц (UMAP) аргыг ашиглан (Нэмэлт зураг 3A–B) бид транскриптом (Зураг 1G) болон протеом (Зураг 1H) дахь миофиберийн хувьсах чанарыг дүрслэн харуулж чадсан. Миофиберүүдийг транскриптомик эсвэл протеомикийн өгөгдлийн аль алинд нь оролцогчдоор (Нэмэлт зураг 3C–D) эсвэл туршилтын өдрүүдээр (Нэмэлт зураг 3E) бүлэглээгүй нь араг ясны булчингийн ширхэгийн субъект доторх хувьсах чанар нь субъект хоорондын хувьсах чанараас өндөр байгааг харуулж байна. UMAP графикт "хурдан" ба "удаан" миофиберүүдийг төлөөлсөн хоёр өөр кластер гарч ирсэн (Зураг 1G–H). MYH7+ (удаан) миофиберүүд нь UMAP1-ийн эерэг туйл дээр бөөгнөрсөн бол MYH2+ ба MYH1+ (хурдан) миофиберүүд нь UMAP1-ийн сөрөг туйл дээр бөөгнөрсөн (Зураг 1I–J). Гэсэн хэдий ч MYH-ийн илэрхийлэлд үндэслэн хурдан татагдах шилэн төрлүүдийн (өөрөөр хэлбэл 2A төрөл, 2X төрөл, эсвэл холимог 2A/2X) хооронд ялгаа гаргаагүй бөгөөд энэ нь MYH1 (Зураг 1I–J) эсвэл ACTN3 эсвэл MYLK2 (Нэмэлт Зураг 4A–B) зэрэг бусад сонгодог 2X миофибер маркерууд нь транскриптом эсвэл протеомыг бүхэлд нь авч үзэхэд өөр өөр миофибер төрлүүдийн хооронд ялгаа гаргадаггүй болохыг харуулж байна. Түүнчлэн, MYH2 ба MYH7-той харьцуулахад цөөн тооны транскрипт эсвэл уураг нь MYH1-тэй эерэг хамааралтай байсан (Нэмэлт Зураг 4C–H), энэ нь MYH1-ийн элбэгшил нь миофибер транскриптом/протеомыг бүрэн тусгадаггүй болохыг харуулж байна. UMAP түвшинд гурван MYH изоформын холимог илэрхийлэлийг үнэлэхэд ижил төстэй дүгнэлтэд хүрсэн (Нэмэлт Зураг 4I–J). Тиймээс 2X ширхэгийг зөвхөн MYH-ийн тоон үзүүлэлт дээр үндэслэн транскрипцийн түвшинд тодорхойлж болох боловч MYH1+ ширхэгийг транскриптом эсвэл протеомыг бүхэлд нь авч үзэхэд бусад хурдан ширхэгээс ялгах боломжгүй юм.
MYH-ээс гадна удаан эслэгийн олон янз байдлыг анхлан судлахын тулд бид удаан эслэгийн төрөлд өвөрмөц дөрвөн уураг: TPM3, TNNT1, MYL3, болон ATP2A22-г үнэлсэн. Удаан эслэгийн дэд хэв шинжүүд нь транскриптомик (Нэмэлт Зураг 5A) болон протеомик (Нэмэлт Зураг 5B)-д MYH7-тэй өндөр боловч төгс биш Пирсоны корреляцийг харуулсан. Удаан эслэгийн ойролцоогоор 25% ба 33% нь транскриптомик (Нэмэлт Зураг 5C) болон протеомик (Нэмэлт Зураг 5D)-д бүх ген/уургийн дэд хэв шинжээр цэвэр удаан эслэг гэж ангилагдаагүй. Тиймээс олон ген/уургийн дэд хэв шинжид суурилсан удаан эслэгийн ангилал нь эслэгийн төрөлд өвөрмөц гэгддэг уургуудын хувьд ч нэмэлт нарийн төвөгтэй байдлыг бий болгодог. Энэ нь нэг ген/уургийн гэр бүлийн изоформ дээр суурилсан эслэгийн ангилал нь араг ясны булчингийн эслэгийн жинхэнэ олон янз байдлыг хангалттай тусгаж чадахгүй байж болохыг харуулж байна.
Хүний араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн фенотипийн хувьсах чанарыг омикс загварын хэмжээнд цаашид судлахын тулд бид үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээ (PCA) ашиглан өгөгдлийн хэмжээст байдлыг тэгшитгэн бууруулсан (Зураг 2A). UMAP графиктай адил оролцогч болон туршилтын өдөр PCA түвшинд ширхэгийн кластерчлалд нөлөөлөөгүй (Нэмэлт зураг 6A–C). Хоёр өгөгдлийн багцад MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлийг PC2-оор тайлбарласан бөгөөд энэ нь удаан татагдах 1-р хэлбэрийн ширхэгүүдийн кластер болон хурдан татагдах 2A, 2X төрөл, холимог 2A/2X ширхэг агуулсан хоёр дахь кластерыг харуулсан (Зураг 2A). Хоёр өгөгдлийн багцад эдгээр хоёр кластер цөөн тооны холимог 1/2A төрлийн ширхэгүүдээр холбогдсон байв. Хүлээгдэж байсанчлан, PC-ийн гол драйверуудын хэт төлөөллийн шинжилгээ нь PC2 нь агшилтын болон бодисын солилцооны гарын үсгээр өдөөгддөг болохыг баталсан (Зураг 2B болон Нэмэлт зураг 6D–E, Нэмэлт өгөгдлийн багц 5–6). Ерөнхийдөө MYH дээр суурилсан шилэн төрөл нь хурдан кластер доторх транскриптом даяар тархсан 2X шилэн гэгддэгээс бусад тохиолдолд PC2 дагуу тасралтгүй хэлбэлзлийг тайлбарлахад хангалттай байсан нь тогтоогджээ.
A. MYH дээр үндэслэн шилэн төрлөөр нь өнгөлсөн транскриптом ба протеомын өгөгдлийн багцын үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) графикууд. B. PC2 ба PC1 дэх транскрипт ба уургийн драйверуудын баяжуулах шинжилгээ. Статистик шинжилгээг clusterProfiler багц болон Бенжамини-Хохбергийн тохируулсан p-утгуудыг ашиглан хийсэн. C, D. Транскриптом дахь эс хоорондын наалдацын генийн онтологийн (GO) нэр томьёо болон протеом дахь костамерын GO нэр томьёоны дагуу өнгөлсөн PCA графикууд. Сумнууд нь транскрипт ба уургийн драйверууд болон тэдгээрийн чиглэлийг илэрхийлнэ. E, F. Удаан/хурдан шилэн төрлөөс хамааралгүй илэрхийлэлийн градиентийг харуулсан клиник ач холбогдолтой шинж чанаруудын жигд олон талт ойролцоолол ба проекц (UMAP) онцлог графикууд. G, H. Транскриптом ба протеом дахь PC2 ба PC1 драйверуудын хоорондын хамаарал.
Гэнэтийн байдлаар MYH дээр суурилсан миофибер төрөл нь хувьсах чанарын хоёр дахь хамгийн өндөр түвшинг (PC2) тайлбарласан бөгөөд энэ нь MYH дээр суурилсан миофибер төрөл (PC1)-тэй холбоогүй бусад биологийн хүчин зүйлүүд нь араг ясны булчингийн ширхэгийн олон янз байдлыг зохицуулахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. PC1-ийн гол хөдөлгөгч хүчний хэт төлөөллийн шинжилгээгээр PC1-ийн хувьсах чанар нь голчлон транскриптом дахь эсийн эсийн наалдац ба рибосомын агууламж, мөн протеом дахь костамер ба рибосомын уургуудаар тодорхойлогддог болохыг тогтоожээ (Зураг 2B ба Нэмэлт Зураг 6D–E, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 7). Араг ясны булчинд костамерууд нь Z-дискийг сарколемматай холбож, хүч дамжуулах, дохио өгөхөд оролцдог. 25 Эсийн эсийн наалдац (транскриптом, Зураг 2C) ба костамер (протеом, Зураг 2D) шинж чанаруудыг ашиглан тэмдэглэсэн PCA графикууд нь PC1-д зүүн тийш хүчтэй шилжилт байгааг харуулсан бөгөөд энэ нь эдгээр шинж чанарууд нь тодорхой ширхэгүүдээр баяжсан болохыг харуулж байна.
UMAP түвшинд миофиберийн бөөгнөрлийг илүү нарийвчлан судалснаар ихэнх шинж чанарууд нь миофиберийн дэд бөөгнөрөлөөс илүү миофиберийн төрлөөс хамааралгүй MYH дээр суурилсан экспрессийн градиентийг харуулсан болохыг тогтоожээ. Энэхүү тасралтгүй байдлыг эмгэг судлалын нөхцөлтэй холбоотой хэд хэдэн ген (Зураг 2E), тухайлбал CHCHD10 (мэдрэлийн булчингийн өвчин), SLIT3 (булчингийн хатингаршил), CTDNEP1 (булчингийн өвчин)-д ажигласан. Энэхүү тасралтгүй байдлыг мэдрэлийн эмгэг (UGDH), инсулины дохиолол (PHIP), транскрипц (HIST1H2AB)-тай холбоотой уургууд (Зураг 2F) зэрэг протеом даяар ажигласан. Эдгээр өгөгдөл нь бүхэлдээ янз бүрийн миофиберүүдийн хооронд шилэн эсийн төрлөөс хамааралгүй удаан/хурдан таталтын олон янз байдлын тасралтгүй байдлыг харуулж байна.
Сонирхолтой нь, PC2-ийн драйвер генүүд нь транскриптом-протеомын сайн корреляци (r = 0.663)-ийг харуулсан (Зураг 2G), энэ нь удаан ба хурдан татагдах ширхэгийн төрлүүд, ялангуяа араг ясны булчингийн ширхэгийн агшилт ба бодисын солилцооны шинж чанарууд нь транскрипцийн хувьд зохицуулагддаг болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч PC1-ийн драйвер генүүд транскриптом-протеомын корреляци (r = -0.027)-ийг харуулаагүй (Зураг 2H), энэ нь удаан/хурдан татагдах ширхэгийн төрлүүдтэй холбоогүй өөрчлөлтүүд нь транскрипцийн дараа ихэвчлэн зохицуулагддаг болохыг харуулж байна. PC1-ийн өөрчлөлтүүдийг голчлон рибосомын генийн онтологийн нэр томьёогоор тайлбарласан бөгөөд рибосомууд нь уургийн орчуулгад идэвхтэй оролцож, нөлөөлөх замаар эсэд чухал бөгөөд мэргэшсэн үүрэг гүйцэтгэдэг тул31 бид дараа нь энэхүү гэнэтийн рибосомын олон янз байдлыг судлахаар явлаа.
Бид эхлээд GOCC-ийн "цитоплазмын рибосом" гэсэн нэр томьёо дахь уургийн харьцангуй элбэгшлийн дагуу протеомикийн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний графикийг өнгөөр ​​будсан (Зураг 3A). Энэ нэр томьёо нь PC1-ийн эерэг тал дээр баяжсан тул бага зэрэг градиент үүсгэдэг боловч рибосомын уургууд нь PC1-ийн хоёр чиглэлд хуваагдлыг өдөөдөг (Зураг 3A). PC1-ийн сөрөг тал дээр баяжуулсан рибосомын уургуудад RPL18, RPS18, болон RPS13 (Зураг 3B) багтсан бол RPL31, RPL35, болон RPL38 (Зураг 3C) нь PC1-ийн эерэг талын гол хөдөлгөгч хүч байв. Сонирхолтой нь, RPL38 болон RPS13 нь бусад эдтэй харьцуулахад араг ясны булчинд өндөр илэрхийлэгддэг (Нэмэлт Зураг 7A). PC1-ийн эдгээр өвөрмөц рибосомын гарын үсэг нь транскриптомд ажиглагдаагүй (Нэмэлт Зураг 7B), энэ нь транскрипцийн дараах зохицуулалтыг харуулж байна.
A. Үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) графикийг протеомын дагуу цитоплазмын рибосомын генийн онтологийн (GO) нэр томьёоны дагуу өнгөөр ​​тэмдэглэсэн. Сумнууд нь PCA график дахь уургаар дамжсан өөрчлөлтийн чиглэлийг заана. Шугамын урт нь өгөгдсөн уургийн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн оноотой тохирч байна. B, C. PCA нь RPS13 ба RPL38-ийн графикуудыг онцолсон. D. Цитоплазмын рибосомын уургуудын хяналтгүй шаталсан кластерчлалын шинжилгээ. E. Араг ясны булчингийн ширхэгт өөр өөр элбэгшилтэй рибосомын уургуудыг тодруулсан 80S рибосомын бүтцийн загвар (PDB: 4V6X). F. mRNA гарах сувгийн ойролцоо байрласан өөр өөр стехиометрийн рибосомын уургууд.
Рибосомын гетероген чанар ба мэргэшлийн тухай ойлголтуудыг өмнө нь санал болгосон бөгөөд үүний дагуу рибосомын дэд популяци (рибосомын гетероген чанар) нь тодорхой mRNA транскриптийн сангийн сонгомол орчуулгаар дамжуулан өөр өөр эд32 ба эс33-д уургийн орчуулгад шууд нөлөөлж болно34 (рибосомын мэргэшүүлэлт). Араг ясны булчингийн ширхэгт хамт илэрхийлэгдсэн рибосомын уургийн дэд популяцийг тодорхойлохын тулд бид протеом дахь рибосомын уургуудын хяналтгүй шаталсан кластерчлалын шинжилгээ хийсэн (Зураг 3D, Нэмэлт өгөгдлийн багц 8). Хүлээгдэж байсанчлан рибосомын уургууд MYH дээр үндэслэн ширхэгийн төрлөөр кластерлагдаагүй. Гэсэн хэдий ч бид рибосомын уургийн гурван өөр кластерыг тодорхойлсон; эхний кластер (ribosomal_cluster_1) нь RPL38-тай хамтран зохицуулагддаг тул эерэг PC1 профайлтай ширхэгт илэрхийлэл нэмэгдсэн. Хоёр дахь кластер (ribosomal_cluster_2) нь RPS13-тай хамтран зохицуулагддаг бөгөөд сөрөг PC1 профайлтай ширхэгт нэмэгддэг. Гурав дахь кластер (ribosomal_cluster_3) нь араг ясны булчингийн ширхэгт зохицуулалттай дифференциал илэрхийлэл үзүүлдэггүй бөгөөд "гол" араг ясны булчингийн рибосомын уураг гэж үзэж болно. Рибосомын 1 ба 2 кластерууд хоёулаа өмнө нь өөр орчуулгыг зохицуулдаг (жишээ нь, RPL10A, RPL38, RPS19, болон RPS25) бөгөөд хөгжилд үйл ажиллагааны хувьд нөлөөлдөг (жишээ нь, RPL10A, RPL38) рибосомын уургуудыг агуулдаг.34,35,36,37,38 PCA-ийн үр дүнтэй нийцэж байгаа тул эдгээр рибосомын уургуудын ширхэгт ажиглагдсан олон янзын төлөөлөл нь мөн тасралтгүй байдлыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 7C).
Рибосомын доторх олон янзын рибосомын уургуудын байршлыг дүрслэхийн тулд бид хүний ​​80S рибосомын бүтцийн загварыг ашигласан (Уургийн мэдээллийн сан: 4V6X) (Зураг 3E). Өөр өөр рибосомын кластерт хамаарах рибосомын уургуудыг тусгаарласны дараа тэдгээрийн байршил хоорондоо нягт уялдаатай байгаагүй нь бидний арга барил рибосомын тодорхой бүс/фракцийг баяжуулж чадаагүйг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч сонирхолтой нь 2-р кластер дахь том дэд нэгжийн уургийн эзлэх хувь 1 ба 3-р кластеруудаас бага байсан (Нэмэлт Зураг 7D). Араг ясны булчингийн ширхэгт өөрчлөгдсөн стехиометрийн уургууд нь голчлон рибосомын гадаргуу дээр байршдаг болохыг бид ажигласан (Зураг 3E), энэ нь өөр өөр мРНХ популяци дахь рибосомын дотоод оролтын талбайн (IRES) элементүүдтэй харилцан үйлчлэх чадвартай нийцэж, улмаар сонгомол орчуулгыг зохицуулдаг. 40, 41 Цаашилбал, араг ясны булчингийн ширхэгт өөрчлөгдсөн стехиометрийн олон уургууд нь тодорхой пептидүүдийн орчуулгын суналт болон зогсолтыг сонгомол байдлаар зохицуулдаг мРНХ гарах хонгил (Зураг 3F) зэрэг функциональ бүсүүдийн ойролцоо байрладаг байв. 42 Товчхондоо, бидний өгөгдөл нь араг ясны булчингийн рибосомын уургийн стехиометр нь олон янз байдлыг харуулдаг бөгөөд энэ нь араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн хооронд ялгаа үүсгэдэг болохыг харуулж байна.
Дараа нь бид хурдан ба удаан татагдах шилэн гарын үсгийг тодорхойлж, тэдгээрийн транскрипцийн зохицуулалтын механизмыг судлахаар явлаа. Хоёр өгөгдлийн багцад (1G-H ба 4A-B зураг) UMAP-аар тодорхойлогдсон хурдан ба удаан татагдах шилэн кластеруудыг харьцуулж, транскриптомик ба протеомик шинжилгээгээр тус тус 1366 ба 804 ялгаатай элбэг шинж чанарыг тодорхойлсон (Зураг 4A-B, Нэмэлт өгөгдлийн багц 9-12). Бид саркомерууд (жишээ нь, тропомиозин ба тропонин), өдөөлт-агшилтын холболт (SERCA изоформууд) болон энергийн солилцоо (жишээ нь, ALDOA ба CKB)-тай холбоотой гарын үсгийн хүлээгдэж буй ялгааг ажигласан. Түүнчлэн, уургийн убиквитинжүүлэлтийг зохицуулдаг транскрипт ба уургууд хурдан ба удаан татагдах шилэнүүдэд (жишээ нь, USP54, SH3RF2, USP28, ба USP48) ялгаатайгаар илэрхийлэгдсэн (Зураг 4A-B). Түүнчлэн, өмнө нь хурганы булчингийн ширхэгийн төрлүүдэд43 ялгаварлан илэрхийлэгдэж, зүрхний булчинд44 SERCA идэвхжилийг нэмэгдүүлдэг болох нь батлагдсан бичил биетний уургийн ген RP11-451G4.2 (DWORF) нь удаан араг ясны булчингийн ширхэгт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 4A). Үүнтэй адилаар, ширхэгийн бие даасан түвшинд бодисын солилцоотой холбоотой лактатын дегидрогеназын изоформууд (LDHA ба LDHB, Зураг 4C ба Нэмэлт Зураг 8A)45,46 зэрэг мэдэгдэж буй шинж тэмдгүүдэд, мөн өмнө нь мэдэгдэж байгаагүй ширхэгийн төрөлд өвөрмөц шинж тэмдгүүдэд (IRX3, USP54, USP28, DPYSL3 гэх мэт) мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдсан (Зураг 4C). Транскриптомик ба протеомик өгөгдлийн багцуудын хооронд ялгаварлан илэрхийлэгдсэн шинж чанаруудын давхцал мэдэгдэхүйц байсан (Нэмэлт Зураг 8B), мөн голчлон саркомерын шинж чанаруудын илүү тод ялгаварлан илэрхийллээс үүдэлтэй нугалаа өөрчлөлтийн корреляци байсан (Нэмэлт Зураг 8C). Зарим гарын үсэг (жишээ нь USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) нь зөвхөн протеомын түвшинд транскрипцийн дараах хүчтэй зохицуулалтыг харуулсан бөгөөд удаан/хурдан таталттай ширхэгийн төрөлд өвөрмөц илэрхийлэлийн профайлтай байсан нь анхаарал татаж байна (Нэмэлт Зураг 8C).
Зураг 1G–H-д үзүүлсэн жигд олон талт ойролцоолол ба проекцийн (UMAP) графикаар тодорхойлогдсон удаан ба хурдан бөөгнөрлийг харьцуулсан А ба В галт уулын графикууд. Өнгөт цэгүүд нь FDR < 0.05 үед мэдэгдэхүйц ялгаатай транскрипт буюу уургуудыг, харин бараан цэгүүд нь лог өөрчлөлт > 1 үед мэдэгдэхүйц ялгаатай транскрипт буюу уургуудыг илэрхийлнэ. Хоёр талын статистик шинжилгээг Бенжамини-Хохбергийн тохируулсан p утгатай (транскриптомик) DESeq2 Валд тест эсвэл Лимма шугаман загварын аргыг ашиглан эмпирик Байесийн шинжилгээгээр, дараа нь олон харьцуулалт хийх Бенжамини-Хохбергийн тохируулгатай (протеомик) хийсэн. C Удаан ба хурдан ширхэгүүдийн хоорондох сонгогдсон ялгавартай илэрхийлэгдсэн ген эсвэл уургийн гарын үсэг графикууд. D Ялгавартай илэрхийлэгдсэн транскрипт болон уургуудын баяжуулах шинжилгээ. Давхцсан утгуудыг хоёр өгөгдлийн багцад баяжуулсан, транскриптомын утгыг зөвхөн транскриптомд, протеомын утгыг зөвхөн протеомд баяжуулсан. Статистик шинжилгээг Бенжамини-Хохбергийн тохируулсан p-утгуудтай clusterProfiler багцыг ашиглан хийсэн. E. SCENIC-ээс гаралтай зохицуулагчийн өвөрмөц байдлын оноо болон шилэн эсийн төрлүүдийн хоорондох mRNA-ийн ялгаатай илэрхийлэл дээр үндэслэн SCENIC-ээр тодорхойлсон шилэн эсийн төрөлд өвөрмөц транскрипцийн хүчин зүйлс. F. Удаан ба хурдан шилэн эсийн хооронд ялгаатай илэрхийлэгдсэн сонгосон транскрипцийн хүчин зүйлсийн профайл.
Дараа нь бид ялгаварлан төлөөлүүлсэн ген ба уургуудын хэт төлөөллийн шинжилгээ хийсэн (Зураг 4D, Нэмэлт өгөгдлийн багц 13). Хоёр өгөгдлийн багцын хооронд ялгаатай шинж чанаруудын замын баяжуулалт нь өөхний хүчлийн β-исэлдэлт ба кетоны солилцооны үйл явц (удаан ширхэгүүд), миофиламент/булчингийн агшилт (тус тус хурдан ба удаан ширхэгүүд), нүүрс усны катаболик үйл явц (хурдан ширхэгүүд) зэрэг хүлээгдэж буй ялгааг илрүүлсэн. Серин/треонин уургийн фосфатазын идэвхжил нь гликогенийн солилцоог зохицуулдаг гэдгээрээ алдартай зохицуулалтын болон каталитик фосфатазын дэд нэгжүүд (PPP3CB, PPP1R3D, ба PPP1R3A) зэрэг шинж чанаруудаас шалтгаалан хурдан ширхэгүүдэд нэмэгдсэн (47) (Нэмэлт зураг 8D–E). Хурдан эслэгээр баяжуулсан бусад замуудад протеом дахь боловсруулах (P-) биетүүд (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (Нэмэлт Зураг 8F), транскрипцийн дараах зохицуулалтад оролцдог (48), транскриптом дахь транскрипцийн хүчин зүйлийн идэвхжил (SREBF1, RXRG, RORA) (Нэмэлт Зураг 8G) багтсан. Удаан эсүүд нь оксидоредуктазын идэвхжил (BDH1, DCXR, TXN2) (Нэмэлт Зураг 8H), амидын холболт (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Нэмэлт Зураг 8I), эсийн гаднах матриц (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Нэмэлт Зураг 8J), рецептор-лиганд идэвхжил (FNDC5, SPX, NENF) (Нэмэлт Зураг 8K)-ээр баяжуулсан.
Удаан/хурдан булчингийн ширхэгийн төрлийн шинж чанарын үндсэн транскрипцийн зохицуулалтын талаар илүү гүнзгий ойлголт авахын тулд бид SCENIC49 (Нэмэлт өгөгдлийн багц 14) ашиглан транскрипцийн хүчин зүйлийн баяжуулалтын шинжилгээ хийсэн. Хурдан ба удаан булчингийн ширхэгүүдийн хооронд олон транскрипцийн хүчин зүйлс мэдэгдэхүйц баяжсан (Зураг 4E). Үүнд өмнө нь хурдан булчингийн ширхэгийн хөгжилтэй холбоотой байсан MAFA зэрэг транскрипцийн хүчин зүйлс,50 мөн булчингийн ширхэгийн төрөлд хамаарах генийн хөтөлбөрүүдтэй өмнө нь холбоогүй хэд хэдэн транскрипцийн хүчин зүйлс багтсан. Эдгээрийн дотор PITX1, EGR1, MYF6 нь хурдан булчингийн ширхэгт хамгийн их баяжуулсан транскрипцийн хүчин зүйлүүд байв (Зураг 4E). Үүний эсрэгээр ZSCAN30 болон EPAS1 (HIF2A гэгддэг) нь удаан булчингийн ширхэгт хамгийн их баяжуулсан транскрипцийн хүчин зүйлүүд байв (Зураг 4E). Үүнтэй уялдуулан MAFA нь хурдан булчингийн ширхэгт харгалзах UMAP бүсэд өндөр түвшинд илэрхийлэгдсэн бол EPAS1 нь эсрэг илэрхийлэлийн хэв маягтай байв (Зураг 4F).
Мэдэгдэж буй уургийн кодчилдог генүүдээс гадна хүний ​​хөгжил, өвчний зохицуулалтад оролцож болох олон тооны кодчилдоггүй РНХ-ийн биотипүүд байдаг. 51, 52 Транскриптомын өгөгдлийн багцад хэд хэдэн кодчилдоггүй РНХ нь шилэн эсийн төрлийн өвөрмөц чанарыг харуулдаг (Зураг 5A болон Нэмэлт өгөгдлийн багц 15), үүнд удаан шилэн эсийн хувьд маш өвөрмөц бөгөөд митохондрийн миопатитай өвчтөнүүдийн булчинд буурсан гэж мэдээлсэн LINC01405 орно. 53 Үүний эсрэгээр, lnc-ERCC5-5 гентэй (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 харгалзах RP11-255P5.3 нь хурдан шилэн эсийн төрлийн өвөрмөц чанарыг харуулдаг. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) болон RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) хоёулаа араг ясны булчингийн өвөрмөц чанарыг харуулдаг (Нэмэлт зураг 9A–B) бөгөөд 1 Mb геномын ойролцоо агшилтын генүүд мэдэгдэхгүй байгаа нь тэдгээр нь хөрш зэргэлдээ агшилтын генийг зохицуулахын оронд эслэгийн төрлийг зохицуулахад тусгай үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна. LINC01405 болон RP11-255P5.3-ийн удаан/хурдан эслэгийн төрөлд өвөрмөц илэрхийлэлийн профайлыг тус тус RNAscope ашиглан баталгаажуулсан (Зураг 5B–C).
A. Кодлогдоогүй РНХ-ийн транскриптүүд нь удаан ба хурдан татагддаг булчингийн ширхэгүүдэд мэдэгдэхүйц зохицуулагддаг. B. LINC01405 ба RP11-255P5.3-ийн удаан ба хурдан татагддаг ширхэгийн төрлийн өвөрмөц байдлыг тус тус харуулсан төлөөллийн РНХ-ийн зураг. Хуваарийн мөр = 50 μм. C. РНХ-ийн аргаар тодорхойлсон миофиберийн төрөлд өвөрмөц кодлогдоогүй РНХ-ийн экспрессийн тоон үзүүлэлт (бие даасан хувь хүмүүсийн n = 3 биопси, хувь хүн бүрийн доторх хурдан ба удаан булчингийн ширхэгүүдийг харьцуулсан). Статистикийн шинжилгээг хоёр сүүлт Стьютний t-тест ашиглан хийсэн. Хайрцагны графикууд нь медиан болон эхний ба гурав дахь квартилуудыг харуулж байгаа бөгөөд сахал нь хамгийн бага ба хамгийн их утгыг зааж байна. D. De novo бичил биетний уургийг тодорхойлох ажлын урсгал (BioRender.com-той хамтран бүтээсэн). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 бичил биетний уураг нь удаан араг ясны булчингийн ширхэгүүдэд онцгойлон илэрхийлэгддэг (бие даасан оролцогчдоос авсан n=5 биопси, оролцогч бүрийн хурдан ба удаан булчингийн ширхэгүүдийг харьцуулсан). Статистикийн шинжилгээг Лимм шугаман загварын аргыг эмпирик Байесийн аргатай хослуулан, дараа нь Бенжамини-Хохбергийн аргыг ашиглан p-утгын тохируулгатай олон харьцуулалт хийсэн. Хайрцагны графикууд нь медиан, эхний ба гуравдугаар квартилуудыг харуулсан бөгөөд сахал нь хамгийн их/хамгийн бага утгыг зааж байна.
Саяхан хийсэн судалгаагаар олон тооны кодчилдоггүй транскриптүүд нь транскрипцлэгдсэн бичил биетний уургуудыг кодчилдог бөгөөд зарим нь булчингийн үйл ажиллагааг зохицуулдаг болохыг харуулсан. 44, 55 Шилэн хэлбэрийн өвөрмөц онцлогтой бичил биетний уургуудыг тодорхойлохын тулд бид 1000 шилэн транскриптомын өгөгдлийн багцад байдаг кодчилдоггүй транскриптүүдийн дарааллыг (n = 305) агуулсан FASTA файлыг ашиглан 1000 шилэн протеомын өгөгдлийн багцаа хайсан (Зураг 5D). Бид 22 өөр транскриптээс 197 бичил биетний уургийг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийн 71 нь удаан ба хурдан араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн хооронд ялгаварлан зохицуулагдсан (Нэмэлт Зураг 9C ба Нэмэлт Мэдээллийн Багц 16). LINC01405-ын хувьд гурван бичил биетний уургийн бүтээгдэхүүнийг тодорхойлсон бөгөөд тэдгээрийн нэг нь транскрипттэйгээ ижил төстэй удаан шилэн өвөрмөц чанарыг харуулсан (Зураг 5E ба Нэмэлт Зураг 9D). Тиймээс бид LINC01405-г удаан араг ясны булчингийн ширхэгүүдэд өвөрмөц бичил биетний уургийг кодчилдог ген гэж тодорхойлсон.
Бид булчингийн ширхэгүүдийн протеомик шинж чанарыг тодорхойлох цогц ажлын урсгалыг боловсруулж, эрүүл төлөв байдалд ширхэгүүдийн гетерогенийн зохицуулагчдыг тодорхойлсон. Бид энэхүү ажлын урсгалыг немалин миопати нь араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн гетерогенд хэрхэн нөлөөлдөгийг ойлгоход ашигласан. Немалин миопати нь булчингийн сулралыг үүсгэдэг удамшлын булчингийн өвчин бөгөөд өртсөн хүүхдүүдэд амьсгалын замын хямрал, сколиоз, мөчний хөдөлгөөн хязгаарлагдмал зэрэг олон төрлийн хүндрэлүүд дагалддаг. 19,20 Ерөнхийдөө немалин миопатид актин альфа 1 (ACTA1) зэрэг генийн эмгэг төрүүлэгч хувилбарууд нь удаан таталттай ширхэгүүдийн миофибер найрлагыг давамгайлдаг боловч энэ нөлөө нь гетероген байдаг. Нэг онцгой тохиолдол бол хурдан ширхэгүүд давамгайлдаг тропонин Т1 немалин миопати (TNNT1) юм. Тиймээс немалин миопатид ажиглагдсан араг ясны булчингийн ширхэгүүдийн зохицуулалтын гажигийн цаад гетерогенийг илүү сайн ойлгох нь эдгээр өвчин ба миофиберийн төрлийн хоорондын нарийн төвөгтэй хамаарлыг тайлахад тусалдаг.
Эрүүл хяналтын бүлэгтэй (бүлэг тус бүрт n=3) харьцуулахад ACTA1 болон TNNT1 генийн мутацитай немалин миопати өвчтэй хүмүүсээс тусгаарлагдсан миофиберүүд нь миофиберийн хатингаршил буюу дистрофи илэрсэн (Зураг 6A, Нэмэлт Хүснэгт 3). Энэ нь боломжит материалын хэмжээ хязгаарлагдмал байсан тул протеомик шинжилгээнд техникийн томоохон бэрхшээл учруулсан. Гэсэн хэдий ч бид 272 араг ясны миофиберээс 2485 уураг илрүүлж чадсан. Нэг ширхэг тутамд дор хаяж 1000 тоон үзүүлэлттэй уураг шүүсний дараа 250 ширхэгийг дараагийн биоинформатик шинжилгээнд хамруулсан. Шүүлтүүрийн дараа нэг ширхэг тутамд дунджаар 1573 ± 359 уураг тоон үзүүлэлттэй болсон (Нэмэлт Зураг 10A, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 17-18). Шилэн хэмжээ мэдэгдэхүйц буурсан ч немалин миопати өвчтэй хүмүүсийн дээжийн протеомын гүн бага зэрэг буурсан нь анхаарал татаж байна. Түүнчлэн, эдгээр өгөгдлийг өөрсдийн FASTA файлууд (кодчилолгүй транскриптийг оруулаад) ашиглан боловсруулснаар немалин миопати өвчтэй хүмүүсийн араг ясны миофиберт таван бичил биетний уургийг тодорхойлох боломжтой болсон (Нэмэлт өгөгдлийн багц 19). Протеомын динамик хүрээ мэдэгдэхүйц өргөн байсан бөгөөд хяналтын бүлгийн нийт уургууд нь өмнөх 1000 ширхэгтэй протеомын шинжилгээний үр дүнтэй сайн хамааралтай байсан (Нэмэлт зураг 10B–C).
A. ACTA1 болон TNNT1 немалин миопати (NM)-д MYH дээр суурилсан эслэгийн хатингаршил эсвэл дистрофи болон өөр өөр төрлийн эслэгийн давамгайллыг харуулсан микроскопийн зургууд. Хуваарийн мөр = 100 μм. ACTA1 болон TNNT1 өвчтөнүүдэд будах чадварыг баталгаажуулахын тулд төлөөллийн зургийг сонгохоос өмнө гурван өвчтөний биопсиг хоёроос гурван удаа (тохиолдол бүрт дөрвөн хэсэг) будсан. B. MYH дээр суурилсан оролцогчдын эслэгийн төрлийн харьцаа. C. Немалин миопати болон хяналтын бүлгийн өвчтөнүүдийн араг ясны булчингийн ширхэгийн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) график. D. Зураг 2-т шинжилсэн 1000 ширхэгээс тодорхойлсон PCA график дээр немалин миопати болон хяналтын бүлгийн өвчтөнүүдийн араг ясны булчингийн ширхэгүүд. Жишээлбэл, ACTA1 болон TNNT1 немалин миопати болон хяналтын бүлгийн оролцогчдын хоорондох ялгааг харьцуулсан галт уулын график. Өнгөт тойрог нь π < 0.05 үед мэдэгдэхүйц ялгаатай уургуудыг, хар цэгүүд нь FDR < 0.05 үед мэдэгдэхүйц ялгаатай уургуудыг заана. Статистик шинжилгээг Лимма шугаман загварын арга болон эмпирик Байесийн аргуудыг ашиглан хийж, дараа нь Бенжамини-Хохбергийн аргыг ашиглан олон харьцуулалт хийхдээ p-утгын тохируулга хийсэн. H. Бүхэл бүтэн протеом болон 1 ба 2A төрлийн ширхэгт мэдэгдэхүйц ялгаатай илэрхийлэгдсэн уургуудын баяжуулах шинжилгээ. Статистик шинжилгээг clusterProfiler багц болон Бенжамини-Хохбергийн тохируулсан p-утгуудыг ашиглан хийсэн. I, J. Эсийн гаднах матриц болон митохондрийн генийн онтологийн (GO) нэр томьёогоор өнгөлсөн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) графикууд.
Немалин миопати нь араг ясны булчин дахь MYH илэрхийлдэг миофиберийн төрлүүдийн эзлэх хувьд нөлөөлж чаддаг тул19,20 бид эхлээд немалин миопатитай өвчтөнүүд болон хяналтын бүлгийн MYH илэрхийлдэг миофиберийн төрлүүдийг судалсан. Бид 1000 миофиберийн шинжилгээнд өмнө нь тайлбарласан шударга аргыг ашиглан миофиберийн төрлийг тодорхойлсон (Нэмэлт Зураг 10D-E) бөгөөд дахин цэвэр 2X миофиберийг тодорхойлж чадаагүй (Зураг 6B). Бид немалин миопати нь миофиберийн төрөлд олон янзын нөлөө үзүүлж байгааг ажигласан, учир нь ACTA1 мутацитай хоёр өвчтөнд 1-р хэлбэрийн миофиберийн эзлэх хувь нэмэгдсэн бол TNNT1 немалин миопатитай хоёр өвчтөнд 1-р хэлбэрийн миофиберийн эзлэх хувь буурсан байна (Зураг 6B). Үнэндээ MYH2 болон хурдан тропонин изоформуудын (TNNC2, TNNI2, болон TNNT3) илэрхийлэл нь ACTA1-немалин миопатид буурсан бол MYH7 илэрхийлэл нь TNNT1-немалин миопатид буурсан (Нэмэлт Зураг 11A). Энэ нь немалин миопатид гетероген миофиберийн төрөл солигдсон талаарх өмнөх тайлангуудтай нийцэж байна.19,20 Бид эдгээр үр дүнг иммуногистохимийн аргаар баталгаажуулж, ACTA1-немалин миопатитай өвчтөнүүдэд 1-р хэлбэрийн миофибер давамгайлж байсан бол TNNT1-немалин миопатитай өвчтөнүүдэд эсрэгээрээ хэв маягтай байсан (Зураг 6A).
Ганц ширхэгт протеомын түвшинд ACTA1 болон TNNT1 немалин миопатитай өвчтөнүүдийн араг ясны булчингийн ширхэгүүд нь хяналтын ширхэгүүдийн дийлэнх хэсэгтэй бүлэглэгдсэн бөгөөд TNNT1 немалин миопатитай ширхэгүүд нь ерөнхийдөө хамгийн их өртсөн (Зураг 6C). Энэ нь өвчтөн бүрийн хувьд хуурамч хөөрөгдсөн ширхэгүүдийн үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээний (PCA) графикийг зурах үед ялангуяа тод харагдаж байсан бөгөөд TNNT1 немалин миопатитай 2 ба 3-р өвчтөнүүд хяналтын дээжээс хамгийн хол харагдаж байв (Нэмэлт Зураг 11B, Нэмэлт Өгөгдлийн Багц 20). Миопатитай өвчтөнүүдийн ширхэгүүд нь эрүүл ширхэгүүдтэй хэрхэн харьцуулж байгааг илүү сайн ойлгохын тулд бид эрүүл насанд хүрсэн оролцогчдоос 1000 ширхэгийн протеомик шинжилгээнээс авсан дэлгэрэнгүй мэдээллийг ашигласан. Бид миопати өгөгдлийн багцаас (ACTA1 болон TNNT1 немалин миопатитай өвчтөнүүд болон хяналтын бүлэг) ширхэгүүдийг 1000 ширхэгт протеомик шинжилгээнээс авсан PCA график дээр тусгасан (Зураг 6D). Хяналтын ширхэгт PC2 дагуух MYH ширхэгийн төрлүүдийн тархалт нь 1000 ширхэг протеомик шинжилгээнээс олж авсан ширхэгийн тархалттай төстэй байв. Гэсэн хэдий ч немалин миопати өвчтэй хүмүүсийн ихэнх ширхэгүүд нь төрөлхийн MYH ширхэгийн төрлөөс үл хамааран PC2 руу шилжиж, эрүүл хурдан татагдах ширхэгүүдтэй давхцаж байв. Тиймээс ACTA1 немалин миопатитай өвчтөнүүд MYH дээр суурилсан аргыг ашиглан тоон үзүүлэлтээр 1-р хэлбэрийн ширхэг рүү шилжсэн боловч ACTA1 немалин миопати болон TNNT1 немалин миопати хоёулаа араг ясны булчингийн ширхэгийн протеомыг хурдан татагдах ширхэг рүү шилжүүлсэн.
Дараа нь бид өвчтөний бүлэг бүрийг эрүүл хяналтын бүлэгтэй шууд харьцуулж, ACTA1 болон TNNT1 немалины миопатид тус тус 256 ба 552 ялгаатай илэрхийлэгдсэн уургийг тодорхойлсон (Зураг 6E–G болон Нэмэлт Зураг 11C, Нэмэлт Өгөгдлийн Багц 21). Генийн баяжуулалтын шинжилгээгээр митохондрийн уургийн зохицуулалттай бууралт илэрсэн (Зураг 6H–I, Нэмэлт Өгөгдлийн Багц 22). Гайхалтай нь, ACTA1 болон TNNT1 немалины миопатид эслэгийн төрлүүд ялгаатай давамгайлж байгаа хэдий ч энэхүү бууралт нь MYH дээр суурилсан эслэгийн төрлөөс бүрэн хамааралгүй байв (Зураг 6H болон Нэмэлт Зураг 11D–I, Нэмэлт Өгөгдлийн Багц 23). ACTA1 эсвэл TNNT1 немалины миопатид гурван бичил биетний уураг зохицуулагдсан. Эдгээр микропротеины хоёр нь болох ENSG00000215483_TR14_ORF67 (LINC00598 эсвэл Lnc-FOXO1 гэгддэг) ба ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) нь зөвхөн 1-р хэлбэрийн миофиберүүдэд ялгаатай элбэгшилтэй байсан. ENSG00000215483_TR14_ORF67 нь эсийн мөчлөгийн зохицуулалтад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг гэж өмнө нь мэдээлсэн. 56 Нөгөөтэйгүүр, эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад ACTA1-немалин миопатитай 1 ба 2А хэлбэрийн миофиберүүдэд ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798-тай тохирч байна) нэмэгдсэн (Нэмэлт Зураг 12A, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 24). Үүний эсрэгээр, рибосомын уургууд нь немалин миопатид бараг нөлөөлөөгүй боловч ACTA1 немалин миопатид RPS17 буурсан (Зураг 6E).
Баяжуулалтын шинжилгээгээр ACTA1 болон TNNT1 немалины миопатид дархлааны системийн үйл явцын зохицуулалт нэмэгдэж байгааг тогтоосон бол TNNT1 немалины миопатид эсийн наалдац нэмэгдсэн байна (Зураг 6H). Эдгээр эсийн гаднах хүчин зүйлсийн баяжилт нь эсийн гаднах матрицын уургууд PC1 болон PC2 дахь PCA-г сөрөг чиглэлд (өөрөөр хэлбэл хамгийн их өртсөн утаснууд руу) шилжүүлснээр тусгагдсан (Зураг 6J). Өвчтөний хоёр бүлэгт дархлааны хариу урвал болон сарколемма нөхөн сэргээх механизмд оролцдог эсийн гаднах уургуудын экспресс нэмэгдсэн, тухайлбал аннексин (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 болон тэдгээрийн харилцан үйлчлэлцдэг уураг S100A1159 (Нэмэлт зураг 12B–C). Энэ үйл явц өмнө нь булчингийн дистрофид сайжирсан гэж мэдээлсэн60 боловч бидний мэдэхийн өмнө немалины миопатитай холбоогүй байсан. Энэхүү молекулын механизмын хэвийн үйл ажиллагаа нь гэмтлийн дараа сарколемма нөхөн сэргээх, шинээр үүссэн миоцитийг миофибертэй нэгтгэхэд шаардлагатай58,61. Тиймээс өвчтөний хоёр бүлэгт энэ үйл явцын идэвхжил нэмэгдсэн нь миофиберийн тогтворгүй байдлаас үүдэлтэй гэмтлийн нөхөн төлжих хариу урвалыг харуулж байна.
Немалин миопати тус бүрийн нөлөө нь сайн хамааралтай (r = 0.736) бөгөөд боломжийн давхцалтай байсан (Нэмэлт Зураг 11A–B) нь ACTA1 болон TNNT1 немалин миопати нь протеомд ижил төстэй нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч зарим уургууд нь зөвхөн ACTA1 эсвэл TNNT1 немалин миопатид зохицуулагддаг байсан (Нэмэлт Зураг 11A ба C). Профибротик уураг MFAP4 нь TNNT1 немалин миопатид хамгийн их зохицуулагдсан уургуудын нэг байсан боловч ACTA1 немалин миопатид өөрчлөгдөөгүй хэвээр байв. HOX генийн транскрипцийг зохицуулах үүрэгтэй PAF1C цогцолборын бүрэлдэхүүн хэсэг болох SKIC8 нь TNNT1 немалин миопатид буурсан боловч ACTA1 немалин миопатид нөлөөлөөгүй (Нэмэлт Зураг 11A). ACTA1 болон TNNT1 немалины миопатитай шууд харьцуулсан нь TNNT1 немалины миопатитай холбоотой митохондрийн уургийн бууралт болон дархлааны системийн уургийн өсөлтийг илүү ихээр харуулсан (Зураг 6G–H болон Нэмэлт Зураг 11C ба 11H–I). Эдгээр өгөгдөл нь TNNT1 немалины миопатитай харьцуулахад TNNT1 немалины миопатид ажиглагдсан хатингаршил/дистрофи ихэссэнтэй нийцэж байгаа бөгөөд энэ нь TNNT1 немалины миопати нь өвчний илүү хүнд хэлбэрийг илэрхийлж байгааг харуулж байна.
Немалин миопатийн ажиглагдсан нөлөө нь булчингийн бүх түвшинд хэвээр байгаа эсэхийг үнэлэхийн тулд бид TNNT1 немалин миопатийн өвчтөнүүдийн ижил бүлэгт авсан булчингийн биопсийн задлан шинжилгээг хийж, тэдгээрийг хяналтын бүлэгтэй (бүлэг тус бүрт n=3) харьцуулсан (Нэмэлт Зураг 13A, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 25). Хүлээгдэж байсанчлан хяналтын бүлэг нь үндсэн бүрэлдэхүүн хэсгийн шинжилгээнд нягт холбоотой байсан бол TNNT1 немалин миопатийн өвчтөнүүд нь дан ширхэгийн шинжилгээнд ажиглагдсантай төстэй дээж хоорондын өндөр хувьсах чанарыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 13B). Задлан шинжилгээ нь бие даасан ширхэгийг харьцуулж тодруулсан ялгаатай илэрхийлэгдсэн уургууд (Нэмэлт Зураг 13C, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 26) болон биологийн процессуудыг (Нэмэлт Зураг 13D, Нэмэлт Мэдээллийн Багц 27) хуулбарласан боловч өөр өөр ширхэгийн төрлийг ялгах чадвараа алдаж, ширхэгийн хоорондох олон янзын өвчний нөлөөллийг тооцоолж чадаагүй.
Эдгээр өгөгдлүүдийг нэгтгэн авч үзвэл дан миофибер протеомикууд нь иммуноблоттинг гэх мэт зорилтот аргуудаар илрүүлэх боломжгүй клиник биологийн шинж чанаруудыг тодруулж чадна гэдгийг харуулж байна. Түүнчлэн, эдгээр өгөгдөл нь фенотипийн дасан зохицох чадварыг тодорхойлохын тулд зөвхөн актин ширхэгийн төрөлжилтийг (MYH) ашиглах хязгаарлалтыг онцолж байна. Үнэндээ, ширхэгийн төрлийг солих нь актин ба тропонин немалин миопати хооронд ялгаатай боловч немалин миопати хоёулаа MYH ширхэгийн төрөлжилтийг араг ясны булчингийн ширхэгийн солилцооноос илүү хурдан, бага исэлддэг булчингийн протеом руу салгадаг.
Эсийн олон янз байдал нь эд эсийн олон янзын хэрэгцээг хангахад чухал үүрэгтэй. Араг ясны булчинд үүнийг ихэвчлэн хүч үйлдвэрлэх, ядрах зэрэг өөр өөр түвшинд тодорхойлогддог ширхэгийн төрөл гэж тодорхойлдог. Гэсэн хэдий ч энэ нь араг ясны булчингийн ширхэгийн хувьсах чанарын зөвхөн багахан хэсгийг тайлбарладаг нь тодорхой бөгөөд энэ нь өмнө нь бодож байснаас хамаагүй илүү хувьсах чадвартай, нарийн төвөгтэй, олон талт юм. Технологийн дэвшил нь одоо араг ясны булчингийн ширхэгийг зохицуулдаг хүчин зүйлсийг тодруулж байна. Үнэндээ бидний өгөгдөл 2X хэлбэрийн ширхэгүүд нь араг ясны булчингийн ширхэгийн тусдаа дэд төрөл биш байж болохыг харуулж байна. Түүнээс гадна, бид бодисын солилцооны уураг, рибосомын уураг болон эстэй холбоотой уургуудыг араг ясны булчингийн ширхэгийн олон янз байдлын гол хүчин зүйлүүд гэж тодорхойлсон. Нематод миопатитай өвчтөний дээжинд протеомик ажлын урсгалаа хэрэглэснээр бид MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрөл нь араг ясны булчингийн олон янз байдлыг бүрэн тусгадаггүй, ялангуяа систем эвдэрсэн үед гэдгийг харуулсан. Үнэндээ MYH дээр суурилсан ширхэгийн төрлөөс үл хамааран нематод миопати нь илүү хурдан, бага исэлддэг ширхэг рүү шилжихэд хүргэдэг.
Араг ясны булчингийн ширхэгүүдийг 19-р зуунаас хойш ангилж ирсэн. Сүүлийн үеийн омикс шинжилгээ нь бидэнд янз бүрийн MYH ширхэгийн төрлүүдийн илэрхийлэлийн профайл болон тэдгээрийн өөр өөр өдөөлтөд үзүүлэх хариу үйлдлийг ойлгож эхлэх боломжийг олгосон. Энд дурдсанчлан, омикс аргууд нь уламжлалт эсрэгбие дээр суурилсан аргуудаас илүү ширхэгийн төрлийн маркеруудыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлоход илүү мэдрэг чанартай байдаг бөгөөд араг ясны булчингийн ширхэгийн төрлийг тодорхойлохын тулд ганц (эсвэл цөөн хэдэн) маркерын тоон үзүүлэлтэд найддаггүй. Бид хүний ​​араг ясны булчингийн ширхэгт ширхэгийн гетероген чанарын транскрипцийн болон транскрипцийн дараах зохицуулалтыг судлахын тулд нэмэлт транскриптомик болон протеомик ажлын урсгалыг ашиглаж, үр дүнг нэгтгэсэн. Энэхүү ажлын урсгал нь эрүүл залуу эрчүүдийн когортын vastus lateralis-д уургийн түвшинд цэвэр 2X төрлийн ширхэгийг тодорхойлж чадаагүйд хүргэсэн. Энэ нь эрүүл vastus lateralis-д <1% цэвэр 2X ширхэг байгааг тогтоосон өмнөх дан ширхэгийн судалгаатай нийцэж байгаа боловч үүнийг ирээдүйд бусад булчинд батлах ёстой. mRNA түвшинд бараг цэвэр 2X ширхэгийг илрүүлэх болон уургийн түвшинд зөвхөн холимог 2A/2X ширхэгийн хоорондох зөрүү нь гайхмаар юм. MYH изоформын mRNA илэрхийлэл нь циркадийн биш бөгөөд67 нь бид РНХ-ийн түвшинд цэвэр 2X ширхэгт MYH2 эхлэх дохиог "алдсан" байх магадлал багатайг харуулж байна. Цэвэр таамаглалтай ч гэсэн нэг боломжит тайлбар нь MYH изоформын хоорондох уураг болон/эсвэл mRNA тогтвортой байдлын ялгаа байж болно. Үнэндээ ямар ч хурдан ширхэг нь MYH изоформын хувьд 100% цэвэр биш бөгөөд MYH1 mRNA илэрхийллийн түвшин 70-90%-ийн хүрээнд байх нь уургийн түвшинд MYH1 ба MYH2-ийн тэнцүү элбэгшилд хүргэх эсэх нь тодорхойгүй байна. Гэсэн хэдий ч транскриптом эсвэл протеомыг бүхэлд нь авч үзэхэд кластер шинжилгээ нь MYH-ийн нарийн найрлагаас үл хамааран удаан ба хурдан араг ясны булчингийн ширхэгийг төлөөлдөг хоёр өөр кластерыг л итгэлтэйгээр тодорхойлж чадна. Энэ нь ихэвчлэн зөвхөн хоёр өөр мионуклеар кластерыг тодорхойлдог дан цөмт транскриптомик аргыг ашигласан шинжилгээтэй нийцэж байна. 68, 69, 70 Цаашилбал, өмнөх протеомик судалгаагаар 2X төрлийн ширхэгүүдийг тодорхойлсон боловч эдгээр ширхэгүүд нь бусад хурдан ширхэгүүдээс тусад нь бөөгнөрдөггүй бөгөөд MYH дээр суурилсан бусад ширхэгийн төрлүүдтэй харьцуулахад цөөн тооны ялгаатай элбэг уураг харуулдаг. 14 Эдгээр үр дүнгээс харахад бид 20-р зууны эхэн үеийн булчингийн ширхэгийн ангиллын үзэл бодол руугаа буцаж орох хэрэгтэй бөгөөд энэ үзэл бодол нь хүний ​​араг ясны булчингийн ширхэгүүдийг MYH дээр үндэслэн гурван өөр ангилалд биш, харин бодисын солилцоо, агшилтын шинж чанарт нь үндэслэн хоёр бүлэгт хуваадаг байжээ. 63
Хамгийн чухал нь миофиберийн олон янз байдлыг олон хэмжээсээр авч үзэх хэрэгтэй. Өмнөх "омикс" судалгаанууд энэ чиглэлд чиглэж байсан бөгөөд араг ясны булчингийн ширхэгүүд нь салангид бөөгнөрөл үүсгэдэггүй, харин тасралтгүй байдлаар байрладаг болохыг харуулж байна. 11, 13, 14, 64, 71 Энд бид араг ясны булчингийн агшилт ба бодисын солилцооны шинж чанарын ялгаанаас гадна миофиберийг эсийн харилцан үйлчлэл ба орчуулгын механизмтай холбоотой шинж чанаруудаар ялгаж болохыг харуулж байна. Үнэндээ бид араг ясны булчингийн ширхэгт рибосомын олон янз байдлыг удаан ба хурдан ширхэгийн төрлөөс үл хамааран олон янз байдалд хувь нэмэр оруулдаг болохыг олж мэдсэн. Удаан ба хурдан ширхэгийн төрлөөс үл хамааран энэхүү мэдэгдэхүйц миофиберийн олон янз байдлын үндсэн шалтгаан нь тодорхойгүй хэвээр байгаа боловч тодорхой хүч, ачаалалд оновчтой хариу үйлдэл үзүүлдэг булчингийн бүлгүүдийн доторх тусгай орон зайн зохион байгуулалт, булчингийн бичил орчин дахь бусад эсийн төрлүүдтэй тусгай эсийн эсвэл эрхтний өвөрмөц харилцаа холбоо, эсвэл бие даасан миофиберүүдийн доторх рибосомын идэвхжилийн ялгааг харуулж магадгүй юм. Үнэндээ, RPL3 ба RPL3L-ийн паралог орлуулалтаар эсвэл рРНХ-ийн 2′O-метилжилтийн түвшинд рибосомын гетероплазми нь араг ясны булчингийн гипертрофитой холбоотой болохыг харуулсан76,77. Олон омгийн болон орон зайн хэрэглээ нь бие даасан миофиберүүдийн функциональ шинж чанартай хослуулан хийснээр булчингийн биологийн талаарх бидний ойлголтыг олон омгийн түвшинд улам бүр ахиулах болно78.
Немалин миопатитай өвчтөнүүдийн дан миофиберийн протеомыг шинжилснээр бид араг ясны булчингийн клиник эмгэг жамыг тодруулахын тулд дан миофиберийн протеомикийн ашиг тус, үр нөлөө, хэрэглээг харуулсан. Түүнчлэн, бидний ажлын урсгалыг дэлхийн протеомик шинжилгээтэй харьцуулснаар бид дан миофиберийн протеомик нь дэлхийн эдийн протеомиктой ижил гүнзгий мэдээлэл өгч, эс хоорондын олон янз байдал болон миофиберийн төрлийг харгалзан үзвэл энэ гүнийг өргөжүүлдэг болохыг харуулж чадсан. Эрүүл хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад ACTA1 ба TNNT1 немалин миопатид ажиглагдсан эсийн төрлийн харьцааны хүлээгдэж буй (хувьсах боловч) ялгаанаас гадна19 бид MYH-зуучлалтай эсийн төрлийн шилжилтээс үл хамааран исэлдэлтийн болон эсийн гаднах өөрчлөлтийг ажигласан. TNNT1 немалины миопатид фиброз өмнө нь бүртгэгдсэн байдаг.19 Гэсэн хэдий ч бидний дүн шинжилгээ нь ACTA1 болон TNNT1 немалины миопатитай өвчтөнүүдийн миофиберүүдэд сарколемма нөхөн сэргээх механизмд оролцдог аннексинууд гэх мэт эсийн гаднах ялгардаг стресстэй холбоотой уургуудын түвшин нэмэгдсэнийг илрүүлснээр энэхүү олдвор дээр үндэслэсэн болно.57,58,59 Эцэст нь хэлэхэд, немалины миопатитай өвчтөнүүдийн миофиберүүдэд аннексины түвшин нэмэгдсэн нь хүнд хэлбэрийн атрофиятай миофиберийг нөхөн сэргээх эсийн хариу урвалыг илэрхийлж болно.
Хэдийгээр энэхүү судалгаа нь өнөөг хүртэлх хүмүүсийн хамгийн том дан ширхэгт бүхэл булчингийн-омик шинжилгээг төлөөлж байгаа ч энэ нь хязгаарлалтгүй биш юм. Бид оролцогчдын харьцангуй бага, нэгэн төрлийн түүвэр болон ганц булчингаас (vastus lateralis) араг ясны булчингийн ширхэгүүдийг тусгаарласан. Тиймээс булчингийн төрлүүд болон булчингийн физиологийн туйлын үед тодорхой ширхэгт популяци байгааг үгүйсгэх боломжгүй юм. Жишээлбэл, өндөр бэлтгэлтэй спринтчид болон/эсвэл хүчний тамирчдад79 эсвэл булчингийн идэвхгүй байдлын үед66,80 хэт хурдан ширхэгтүүдийн дэд хэсэг (жишээлбэл, цэвэр 2X ширхэгтүүд) үүсэх боломжийг үгүйсгэх боломжгүй юм. Цаашилбал, оролцогчдын хязгаарлагдмал түүврийн хэмжээ нь бидэнд ширхэгтийн гетерогенийн хүйсийн ялгааг судлахад саад болсон, учир нь ширхэгтийн төрлийн харьцаа эрэгтэй, эмэгтэй хүмүүсийн хооронд ялгаатай байдаг. Цаашилбал, бид ижил булчингийн ширхэгтүүд эсвэл ижил оролцогчдын дээжинд транскриптомик болон протеомик шинжилгээ хийх боломжгүй байсан. Бид болон бусад хүмүүс хэт бага дээжийн оролтыг (митохондрийн миопатитай өвчтөнүүдийн ширхэгийн шинжилгээнд харуулсанчлан) авахын тулд омикс шинжилгээг ашиглан дан эсийн болон дан миофиберийн шинжилгээг оновчтой болгосноор дан булчингийн ширхэг дотор олон омикс (болон функциональ) аргуудыг хослуулах боломж тодорхой болж байна.
Ерөнхийдөө бидний өгөгдөл нь араг ясны булчингийн олон янз байдлын транскрипцийн болон транскрипцийн дараах хөдөлгөгч хүчийг тодорхойлж, тайлбарладаг. Тодруулбал, бид шилэн эсийн сонгодог MYH дээр суурилсан тодорхойлолттой холбоотой араг ясны булчингийн физиологийн чиглэлээр удаан хугацаанд баримталж ирсэн онолын эсрэгцэл бүхий өгөгдлийг танилцуулж байна. Бид мэтгэлцээнийг шинэчилж, эцэст нь араг ясны булчингийн шилэн эсийн ангилал ба олон янз байдлын талаарх ойлголтоо дахин авч үзэхийг хүсч байна.
Энэхүү судалгаанд оролцохоор Кавказ гаралтай арван дөрвөн оролцогч (12 эрэгтэй, 2 эмэгтэй) сайн дураараа зөвшөөрсөн. Судалгааг Гентийн Их Сургуулийн Эмнэлгийн Ёс зүйн Хороо (BC-10237) баталж, 2013 оны Хельсинкийн Тунхаглалыг дагаж мөрдөж, ClinicalTrials.gov (NCT05131555) хаягаар бүртгүүлсэн. Оролцогчдын ерөнхий шинж чанарыг Нэмэлт Хүснэгт 1-д үзүүлэв. Амаар болон бичгээр мэдээлэл өгсөн зөвшөөрөл авсны дараа оролцогчид судалгаанд эцсийн байдлаар хамрагдахаасаа өмнө эрүүл мэндийн үзлэгт хамрагдсан. Оролцогчид залуу (22-42 нас), эрүүл (эмнэлгийн асуудалгүй, тамхи татдаггүй), дунд зэргийн идэвхтэй бие бялдартай байв. Өмнө нь тайлбарласны дагуу бие бялдрын чийрэгжилтийг үнэлэхийн тулд алхам эргометр ашиглан хүчилтөрөгчийн хамгийн их хэрэглээг тодорхойлсон. 81
Булчингийн биопсийн дээжийг амарч, мацаг барих байдалд гурван удаа, 14 хоногийн зайтай цуглуулсан. Эдгээр дээжийг илүү том судалгааны нэг хэсэг болгон цуглуулсан тул оролцогчид биопси хийхээс 40 минутын өмнө плацебо (лактоз), H1 рецепторын антагонист (540 мг фексофенадин) эсвэл H2 рецепторын антагонист (40 мг фамотидин) хэрэглэсэн. Бид өмнө нь эдгээр гистамины рецепторын антагонистууд нь амарч буй араг ясны булчингийн эрүүл мэндэд нөлөөлдөггүй болохыг харуулсан81 бөгөөд чанарын хяналтын графикт (Нэмэлт Зураг 3, 6) ямар ч төлөв байдалтай холбоотой кластер ажиглагдаагүй. Туршилтын өдөр бүрийн өмнө 48 цагийн турш стандартчилсан хоолны дэглэм (биеийн жин 41.4 ккал/кг, биеийн жин 5.1 г/кг нүүрс ус, биеийн жин 1.4 г/кг уураг, биеийн жин 1.6 г/кг өөх тос) хадгалж, туршилтын өдрийн өглөө стандартчилсан өглөөний цай (биеийн жин 1.5 г/кг нүүрс ус) хэрэглэсэн. Орон нутгийн мэдээ алдуулалтын дор (адреналингүй 0.5 мл 1% лидокаин) Бергстрём соролтыг ашиглан vastus lateralis булчингаас булчингийн биопси авсан.82 Булчингийн дээжийг дараа нь РНХ-д нэн даруй суулгаж, гараар эсийг задлах хүртэл 4°C-д (3 хүртэл хоног) хадгалсан.
Шинээр тусгаарлагдсан миофиберийн багцуудыг өсгөврийн аяганд шинэхэн РНХ-латер орчинд шилжүүлэв. Дараа нь миофибер тус бүрийг стереомикроскоп болон нарийн хясаа ашиглан гараар задлан шинжилсэн. Биопси бүрээс хорин таван ширхэгийг задлан шинжилсэн бөгөөд биопсийн өөр өөр хэсгээс ширхэг сонгоход онцгой анхаарал хандуулсан. Задлан шинжилсний дараа ширхэг бүрийг хүсээгүй уураг болон ДНХ-г зайлуулахын тулд протеиназа К болон ДНХ фермент агуулсан 3 мкл лизисийн буфер (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad)-д зөөлөн дүрсэн. Дараа нь эсийн лизис болон уураг/ДНХ-ийг зайлуулах ажлыг богино хугацаанд эргүүлж, шингэнийг микроцентрифугт эргүүлж, өрөөний температурт (10 минут) инкубаци хийх замаар эхлүүлсэн. Дараа нь лизатыг дулааны циклер (T100, Bio-Rad)-д 37°C-д 5 минут, 75°C-д 5 минут инкубацилж, дараа нь цаашдын боловсруулалт хүртэл -80°C-д нэн даруй хадгалсан.
Illumina-тэй нийцтэй полиаденилжүүлсэн РНХ сангуудыг QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) ашиглан 2 µl миофибер лизатаас бэлтгэсэн. Дэлгэрэнгүй аргуудыг үйлдвэрлэгчийн гарын авлагаас олж болно. Энэ үйл явц нь урвуу транскрипцийн аргаар эхний судалтай кДНХ-ийн синтезээс эхэлдэг бөгөөд энэ үед өвөрмөц молекулын танигч (UMI) болон дээжинд тохирсон i1 бар кодыг нэвтрүүлж, дээжийг нэгтгэж, дараагийн боловсруулалтын явцад техникийн хувьсах чанарыг бууруулдаг. Дараа нь 96 миофиберээс авсан кДНХ-ийг нэгтгэж, соронзон бөмбөлгөөр цэвэршүүлдэг бөгөөд үүний дараа РНХ-г авч, санамсаргүй праймер ашиглан хоёр дахь судалтай синтезийг хийдэг. Номын санг соронзон бөмбөлгөөр цэвэршүүлж, усан сангийн тодорхой i5/i7 шошгыг нэмж, PCR-ийг олшруулдаг. Эцсийн цэвэршүүлэх алхам нь Illumina-тэй нийцтэй сангуудыг үүсгэдэг. Номын сангийн сан бүрийн чанарыг Өндөр мэдрэмжит жижиг хэлтэрхийн ДНХ-ийн шинжилгээний хэрэгсэл (Agilent Technologies, DNF-477-0500) ашиглан үнэлсэн.
Qubit-ийн тоон үзүүлэлтэд үндэслэн цөөрмүүдийг эквимоляр концентрацид (2 нМ) нэгтгэсэн. Дараа нь үүссэн цөөрмийг NovaSeq 6000 багаж дээр стандарт горимд 2 нМ ачаалалтай (4% PhiX) NovaSeq S2 урвалжийн хэрэгсэл (1 × 100 нуклеотид) ашиглан дарааллаар нь ангилсан.
Манай дамжуулах хоолой нь Lexogen-ийн QuantSeq Pool өгөгдлийн шинжилгээний дамжуулах хоолой (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) дээр суурилсан. Өгөгдлийг эхлээд i7/i5 индекс дээр үндэслэн bcl2fastq2 (v2.20.0)-ээр демультиплекслэсэн. Дараа нь 2-р уншлагыг i1 дээжийн бар код дээр үндэслэн idemux (v0.1.6)-аар демультиплекслэсэн бөгөөд UMI дарааллыг umi_tools (v1.0.1) ашиглан гаргаж авсан. Дараа нь богино уншлагыг (<20 урттай) эсвэл зөвхөн адаптерийн дарааллаас бүрдсэн уншлагыг арилгахын тулд уншлагыг cutadapt (v3.4) ашиглан олон удаагийн эргэлтээр тайрсан. Дараа нь уншлагыг STAR (v2.6.0c) ашиглан хүний ​​геномтой уялдуулж, BAM файлуудыг SAMtools (v1.11) ашиглан индексжүүлсэн. Давхардсан уншлагыг umi_tools (v1.0.1) ашиглан устгасан. Эцэст нь, уялдуулах тооллогыг Subread (v2.0.3) дахь featureCounts ашиглан гүйцэтгэсэн. Чанарын хяналтыг дамжуулах хоолойн хэд хэдэн завсрын үе шатанд FastQC (v0.11.9) ашиглан гүйцэтгэсэн.
Цаашдын бүх биоинформатик боловсруулалт болон дүрслэлийг R (v4.2.3) дээр голчлон Seurat (v4.4.0) ажлын урсгалыг ашиглан гүйцэтгэсэн. 83 Тиймээс UMI-ийн бие даасан утга болон мета өгөгдлийн матрицыг Seurat объект болгон хувиргасан. Бүх ширхэгийн 30%-иас бага хэмжээгээр илэрхийлэгдсэн генийг хассан. Чанар муутай дээжийг 1000 UMI утга болон 1000 илэрсэн генийн хамгийн бага босго дээр үндэслэн хассан. Эцэст нь 925 ширхэг нь чанарын хяналтын бүх шүүлтүүрийн алхмуудыг давсан. UMI утгыг Seurat SCTransform v2 аргыг ашиглан хэвийн болгосон бөгөөд 84 нь илэрсэн бүх 7418 шинж чанарыг багтаасан бөгөөд оролцогчдын хоорондох ялгааг бууруулсан. Холбогдох бүх мета өгөгдлийг Нэмэлт мэдээллийн багц 28-аас олж болно.